Cuando hace pocos días me enteré que los científicos Rosa Ruiz Vázquez, Santiago Torres y Francisco Esteban Nicolás, del grupo Genómica y Biotecnología Molecular de Hongos de la Universidad de Murcia, en colaboración con investigadores de la Universidad de Duke (EE UU), acababan de publicar un artículo en la revista Nature que describe un novedoso mecanismo de resistencia a antibióticos que puede servir como base para desarrollar tratamientos para enfermedades provocadas por algunos hongos, tuve claro lo que debía hacer: proponerles que escribiesen un artículo de divulgación para la sección “Colaboraciones” de SCIENTIA en el que contaran el descubrimiento que les había llevado a publicar sus resultados en la mejor revista científica del mundo.

De izquierda a derecha: Francisco E. Nicolás, Rosa Ruiz y Santiago Torres.

Debo reconocer que para lograr que accediesen a mi propuesta hice trampa. Conocedor del gran interés que Santiago Torres, catedrático de Genética de la Universidad de Murcia y compañero de la Facultad de Biología, tiene por la divulgación científica, le abordé en un traicionero momento en el que no podía decirme que no. Justo antes de empezar una charla en la que yo actuaba como moderador le pedí que escribiese para esta bitácora y en el momento que escuché un “SÍ” me largué corriendo antes de que se arrepintiese… aunque sé que no lo iba a hacer. Además de sus labores docentes e investigadoras Santiago es un gran amante de la divulgación científica.

Sin más les dejo con el texto escrito por Santiago Torres al que no sólo quiero felicitar por su éxito científico sino también agradecer enormemente su predisposición a divulgar los resultados publicados en Nature en SCIENTIA.

«Resistencia a antibióticos mediada por RNAi”

El artículo publicado el pasado 25 de septiembre en la revista Nature describe un novedoso mecanismo de resistencia espontánea a tratamientos con antibióticos antifúngicos. Los microorganismos, como bacterias y hongos, suelen esquivar esos tratamientos adquiriendo, de forma espontánea, mutaciones en los genes que cifran a las proteínas que son las dianas de esos fármacos. Estas mutaciones son permanentes, ya que son alteraciones de la secuencia de un gen que se heredan de una generación a la siguiente. Hasta ahora se pensaba que esa era la única forma de adquirir resistencias a fármacos. Lo que se demuestra en el artículo de Nature es que algunos hongos, como Mucor, pueden utilizar mecanismos distintos para resistir a ciertos antifúngicos. Además, se demuestra que esa resistencia no es permanente, y desaparece cuando desaparece el fármaco. Esta resistencia efímera se basa en la utilización del silenciamiento génico mediado por RNA, un mecanismo bien conocido en muchos organismos que se utiliza básicamente para dos propósitos, como mecanismo de defensa contra virus y transposones (elementos genéticos móviles), y para regular funciones endógenas. El descubrimiento de que en Mucor es utilizado también para poner en marcha un mecanismo de resistencia a antifúngicos es una autentica novedad, y el hecho de que además pueda ser utilizado por otros microorganismos, para resistir a los tratamientos con antibióticos, añade una dimensión extraordinaria al descubrimiento. De hecho, esta respuesta basada en el silenciamiento génico podría explicar múltiples observaciones, hasta ahora inexplicables, de fenotipos transitorios que sólo se manifestaban en presencia de determinadas condiciones ambientales.

El trabajo publicado en Nature es, además, un buen ejemplo de sinergia entre las capacidades y experiencias de dos grupos de investigación distintos y distantes. De una parte, el grupo de Joe Heitman, del Duke University Medical Center, en Carolina del Norte, que estudia desde hace muchos años las bases moleculares del mecanismo de acción de ciertos antifúngicos, como la rapamicina (sirolimus) y el FK506 (tacrolimus), y de la resistencia a dichos fármacos en ciertos hongos que son patógenos en humanos. Tanto la rapamicina como el FK506 son dos conocidos inmunosupresores, utilizados para prevenir el rechazo de transplantes. Los dos compuestos tienen, además, una potente actividad antifúngica en hongos como Mucor, un patógeno oportunista que es uno de los principales agentes causales de la mucormicosis, una enfermedad emergente que tiene un alto índice de mortalidad en pacientes inmunodeprimidos, especialmente en receptores de transplantes. En los últimos años, no obstante, la aparición de casos en pacientes inmunocompetentes ha incrementado notablemente el interés por profundizar en el estudio de las bases moleculares de la virulencia en Mucor, así como las de su respuesta a los agentes antifúngicos.

La rapamicina y el FK506 son dos compuestos muy parecidos estructuralmente y los dos inhiben el sistema inmune en mamíferos al bloquear la activación de los linfocitos T. Si bien los dos compuestos se unen inicialmente a la misma diana, la proteína FKBP, una proteína muy conservada en eucariotas, los complejos FKBP-rapamicina y FKBP-FK506 inhiben el sistema inmune a través de rutas bien distintas. La rapamicina lo hace a través de la ruta de señalización TOR («Target Of Rapamycin»), y el FK506 a través de la calcineurina, una fosfatasa dependiente de calcio que es estimulada por la calmodulina y que es responsable de la síntesis de interleucina-2 (IL-2) y de la estimulación del crecimiento y diferenciación de los linfocitos T.

Mucor circinelloides

En el caso de Mucor, la inhibición de la calcineurina por el complejo FKBP-FK506 provoca el bloqueo del crecimiento del hongo en forma de hifa, que es la forma patogénica. A priori, cabía esperar que los mutantes espontáneos resistentes a FK506 tuviesen mutaciones en el gen que cifra a la proteína FKBP12, que es como se denomina a la diana del antifúngico en Mucor, o en algunos de los genes de la calcineurina. Sorprendentemente, lo que el grupo de Heitman comprobó es que eso era cierto en algunos casos, pero que en otros muchos las estirpes resistentes al antifúngico no presentaban mutaciones en ninguno de esos genes. Y no sólo eso, sino que en estas estirpes que no presentaban mutaciones en el gen FKBP (fkbA en Mucor) tampoco se detectaba la correspondiente proteína, ni el RNA mensajero. Además, esos resistentes espontáneos revertían con facilidad al fenotipo silvestre (sensibles) cuando se cultivaban en ausencia del fármaco.

¿Qué estaba pasando en esos “mutantes” resistentes al antibiótico, que no presentaban mutaciones, ni RNA ni proteína FKBP12? La respuesta fue posible gracias al trabajo desarrollado por el grupo de Murcia, liderado por la Dra. Rosa Ruiz Vázquez. Nuestro grupo descubrió hace ya más de una década que Mucor posee, al igual que otros muchos organismos, la maquinaria de genes y proteínas implicados en el mecanismo de silenciamiento génico mediado por RNA. Y gracias al trabajo desarrollado en los últimos años, hemos podido comprobar que no sólo es un mecanismo de defensa contra virus y transposones, sino que además desempeña un importante papel en el control de la regulación de funciones como el desarrollo y la patogénesis. Este mecanismo de silenciamiento génico actúa una vez que el gen “se ha expresado” (transcrito) y se ha generado el RNA mensajero (RNAm). Por ello se denomina “post-transcripcional”. El resultado final es la degradación del RNAm que es la diana del mecanismo de silenciamiento. De ahí que no se detecte ni el RNAm ni la proteína correspondiente. Y la “firma” de que está ocurriendo silenciamiento es la presencia de unas pequeñas moléculas de RNA (de 21 a 24 nucleótidos) cuyas secuencias coinciden con las del RNAm que se está degradando. Y esas pequeñas moléculas de RNA (sRNAs), correspondientes al gen fkbA son las que se detectaban en los mutantes resistentes espontáneos que crecían en presencia del antifúngico. Este mecanismo de resistencia no es genético en sentido estricto (no se debe a mutaciones) sino epigenético, ya que no es consecuencia de un cambio en la secuencia de DNA del gen. Por ello, a los mutantes se les denomina “epimutantes”.

Epimutante resistente al antibiótico (crecimiento micelial) surgiendo de una colonia sensible a la droga, que crece en forma de levadura. (Foto: Soo Chan Lee)

En resumen, el antifúngico FK506 (tacrolimus) inhibe el crecimiento de Mucor, pero ocasionalmente aparecen mutantes resistentes, que crecen normalmente en presencia del fármaco. Muchos de esos mutantes son epimutantes, en los que FK506 ha inducido la transcripción antisentido (en sentido contrario) del gen fkbA, responsable de la proteína FKBP12, que es la diana de FK506. Cuando están presentes las dos moléculas de RNA, la normal y la antisentido, forman una molécula de doble cadena, que es la que induce el mecanismo de silenciamiento génico. Como consecuencia de ello, se generan las pequeñas moléculas de sRNAs, que son finalmente las causantes (con la ayuda de proteínas de la maquinaria de silenciamiento) de la degradación del RNAm de fkbA y, por tanto, de que el hongo resista al antifúngico, ya que en estos epimutantes no se está produciendo la proteína FKBP12, diana del tacrolimus.

Afortunadamente, la ciencia no entiende de fronteras, y una vez más se demuestra que la colaboración es mucho más beneficiosa que el aislamiento, y que cuando se comparte se avanza más y mejor.

Santiago Torres.

Gracias Santiago, enormemente agradecido.

Jose

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Fuente: Calo, Shertz-Wall, Lee, Bastidas, Nicolás, Granek, Mieczkowski, Torres-Martínez, Ruiz-Vázquez, Cárdenas & Heitman. Antifungal drug resistance evoked via RNAi-dependent epimutations. Nature 513, 555–558 (25 September 2014) doi:10.1038/nature13575