Tres patéticos hobbits

Tras 6 duras batallas en las que luché ferozmente hasta ir encapsulando uno por uno a todos los miembros de la absurda y patética comunidad del anillo formada por hobbits, elfos, enanos, hombres, árboles y demás piltrafas de medio pelo de la Tierra Media, hoy, el gran Sauron, ha puesto el punto de mira sobre los tres principales protagonistas de la trilogía de Tolkien: Frodo, Sam y Gollum… mis hobbits preferidos.

Debo reconocer que separar, aislar y aniquilar a estos tres patéticos personajes para lograr apropiarme del famoso anillo no fue nada fácil. Mis tropas de orcos no lo habían logrado tras muchos intentos así que tuve que desplegar a mis ejércitos encapsulantes, las ciclodextrinas, para que junto a mi técnica instrumental preferida, la cromatografía líquida, conseguir aislarlos uno a uno y posteriormente destruirlos… y todo lo que les voy a contar ocurrió en el camino de Cirith Ungol, el lugar  que eligió Gollum para tender la trampa final a Frodo y Sam tras no poder atravesar la puerta de Mordor.

De estos tres personajillos el primero al que elegí para caer en mis redes fue Gollum, el hobbit al que anteriormente se le conocía por Sméagol y que condujo a Frodo y a Sam a Mordor tras mil y una peripecias. Estarán conmigo que Gollum era un tipo repugnante, que olía mal, con una estructura amorfa pero muy difícil de atrapar…todo un hidroperóxido. Estos compuestos, productos de la oxidación de los ácidos grasos poliinsaturados (PUFA) por la enzima lipoxigenasa son moléculas altamente inestables, como Gollum, y que ejercen un papel fundamental en el desarrollo de malos olores en diversos productos, igualitos que nuestro pestoso hobbit….y por ello había que atraparlos y aniquilarlos.

En un principio intenté emplear la estrategia usada para capturar a “Légolas, el elfo que cayó en la trampa del arándano…” pero en el caso que hoy nos ocupa mis ciclodextrinas, los mejores agentes encapsulantes que conozco, no pudieron hacerse con los hidroperóxidos.

HPLC

¿Por qué Gollum no pudo ser encapsulado por las ciclodextrinas? Pues porque para que un compuesto pueda formar complejos de inclusión con las reinas de la encapsulación molecular debe tener no solamente la hidrofobicidad adecuada sino también una estructura óptima. Pues bien, este feo hobbit (una criatura horrible con las patas palmeadas, el cuerpo delgado, unos miembros largos y huesudos, unos ojos verdosos y brillantes adaptados a la obscuridad y un pelo ralo) poseía, al igual que los inestables hidroperóxidos, una estructura irregular y poco ideal para poder entrar en el interior de las ciclodextrinas.

Pero aunque el escurridizo Gollum no se dejó encapsular… Sauron tenía otra arma para analizar este hidroperóxido: la misteriosa cromatografía liquida de alta resolución en fase reversa (RP-HPLC).

En un primer momento pensé que un simple análisis cromatográfico me permitiría capturar fácilmente al hidroperóxido. Por ello decidí emplear una fase móvil estándard (THF–MeOH–Agua–HAc 25:30:45:0.1) para aislar al horrible hobbit. Sin embargo, una desagradable sorpresa me llevé tras el primer análisis: el hidroperóxido del ácido linoleico tenía un tiempo de retención excesivamente elevado (alrededor de 43 minutos) por lo que el análisis podría arrastrar diferentes errores. Además, este hecho provocaba un gran gasto económico en disolventes y el número de muestras que se podrían analizar en el caso de querer estandarizar el método era bajo…había que intentar otro plan para atraer a Gollum a menos de 10 minutos.

Y no tardé en encontrar la solución. La cromatografía líquida de alta resolución, el arma preferida del Gran Ojo sin Párpado, le tenía una sorpresa preparada a los hidroperóxidos: la fuerza iónica. Si sustituimos en esa fase móvil el H₂O por tampón fosfato que posea baja fuerza iónica (aproximadamente 20 mM) esos 43 minutos se redujeron a 30… pero todavía no era suficiente así que seguí incrementando la fuerza iónica del medio hasta que, al emplear un tampón con una concentración de fosfato de 0.1M, llegó el resultado apetecido: el tiempo necesario para identificar al hidroperóxido, y por tanto para capturarlo más fácilmente, se redujo sustancialmente hasta aproximadamente 8 minutos.

¿Podrían decirme en cuál de los dos cromatogramas superpuestos se ha utilizada una fase móvil con alta fuerza iónica?

¡¡Logrado!! Gollum, el hidroperóxido maloliente e inestable producido por la oxidación del ácido linoleico a través de la enzima lipoxigenasa, que en un principio no podíamos atraparlo debido a su alto tiempo de retención, lo capturamos en nuestras redes cuando mis tropas iónicas emplearon la fase móvil THF–MeOH–Tampón fosfato 0.1M–HAc  (25:30:45:0.1).

Lo siento Sméagol. Jamás debiste estrangular a Déagol para apropiarte de su anillo en el día de tu cumpleaños, y mucho menos salir de aquella caverna donde Bilbo Bolson te robó tu tesoro tras la lucha de adivinanzas una vez que ya te habías convertido en Gollum… ahora te toca a ti morir.

Una vez atrapado por mi fuerza iónica el resto de la faena fue fácil: lo aniquilé con una de mis enzimas preferidas, la hidroperóxido liasa, y lo convertí en un grupo de compuestos volátiles, preferentemente aldehídos y cetonas, que rápidamente se perdieron en la atmósfera… y por si fuera poco todo esto lo publiqué en la revista Journal of Chromatography A bajo el título de “Rapid reversed-phase high-performance liquid chromatographic determination of the regiospecificity of lipoxygenase products on linoleic acid”.

Eso sí, si intentan reproducirlo empleen un pH alrededor de 7.0 porque es mucho más fácil trabajar en cromatografía líquida cuando el compuesto en cuestión está deprotonado… pero de eso les hablaré otro día porque aun nos queda hoy faena.

Ejército de ciclodextrinas naturales

Una vez capturado Gollum faltaba lo más difícil, algo que ni el feo hobbit ni mis orcos habían logrado en toda la famosa trilogía: atrapar a los dos héroes de la Comunidad del Anillo: Frodo Bolsón de Bolsón Cerrado, el portador del anillo, y a Sam Gamyi, jardinero de Bolsón Cerrado.

Si ustedes recuerdan, en realidad Frodo y Sam parecían un solo hobbit. Siempre juntos, uno pendiente del otro, inseparables…estos dos amigos se parecían uno al otro cual enantiómeros…y ahí estuvo la clave de su encapsulación: en la habilidad de las ciclodextrinas, mis ejércitos encapsulantes, para separar enantiómeros.

En química, los enantiómeros, también llamados isómeros ópticos, son una clase de estereoisómeros tales que en la pareja de compuestos uno es imagen especular del otro y no son superponibles, es decir, cada uno es una imagen especular no superponible con la otra, lo mismo que una mano respecto a la otra… como Frodo y Sam.

Respecto a sus principales características las dos formas enantiómeras tienen las mismas propiedades físicas excepto la interacción con la luz polarizada en un plano: un isómero desvía el plano de polarización hacia la derecha, mientras el otro isómero lo desvía en la dirección contraria…. Y por eso Frodo y Sam se pasaron medio viaje por la Tierra Media discutiendo. Por otra parte los enantiómeros también tienen las mismas propiedades químicas, excepto si reaccionan con otras moléculas quirales. De hecho, los enantiómeros son moléculas quirales (aunque la mezcla en cantidades equimolares de cada enantiómero en una solución se denomina mezcla racémica y es ópticamente inactiva)  y esa quiralidad hacía que dos enantiómeros puedan presentar diferente actividad biológica.

Los enantiómeros Frodo y Sam

Pues bien, uno de los principales problemas que tiene el análisis por Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC) de enantiómeros quirales es que la mayoría de las veces es difícil separar esta pareja de compuestos en dos picos cromatográficos claramente definidos, apareciendo solamente uno que integraba a los dos enantiómeros.

¿Y por qué esto es un problema? Pues porque a veces las propiedades funcionales o saludables de dos enantiómeros no son las mismas y al separarlos logramos aislar el que más nos interese…. y en este caso, por ser el portador del anillo, al Señor Oscuro de Mordor le interesaba quedarse con uno solo de los dos inseparables hobbits: Frodo Bolson.

La forma que se le ocurrió a Sauron para separar estos dos enantiómeros para conseguir el anillo de Frodo fue la siguiente. Mi ejército de ciclodextrinas es tremendamente selectivo y tiene la capacidad de reconocer esas pequeñas diferencias entre los dos enantiómeros de forma que la encapsulación de los dos es totalmente distinta para cada uno de ellos. Eso provoca que al adicionar ciclodextrinas al medio de reacción se formen dos complejos diferentes que, cuando se usa la cromatografía líquida UPLC como medio de análisis, eluyan a diferentes tiempos de retención…. y así ya tendría separados a los dos hobbits.

Estructura de un hobbit…quiral

Como pueden observar en la anterior figura la estructura de todos los hobbits es muy similar presentando una amina terciaria y un anillo aromático. Sin embargo la existencia de un centro quiral en la posición alfa de dicho anillo daba lugar a la presencia de dos enantiómeros (Frodo y Sam)… no, no he bebido para decir esto.

En un análisis cromatográfico estándard en el que se utilice una fase móvil formada por H₂O/acetonitrilo (85/15, v/v) es absolutamente imposible separar a los dos enantiómeros ya que se observa un solo pico cromatográfico. Sin embargo fíjense qué ocurre cuando Sauron introdujo  uno de mis más potentes soldados: la sulfated beta–cyclodextrin (S-β-CD) en el medio de reacción a 20º.

Separación de los enantiómeros Frodo y Sam por UPLC con ciclodextrinas

Cuando solamente han transcurridos dos minutos aparecen dos picos claramente diferenciados correspondientes uno de ellos, el mayoritario, al complejo ciclodextrina/Enantiómero R (Frodo Bolsón de Bolsón Cerrado) y otro, el minoritario, al complejo ciclodextrina/Enantiómero S (Sam Gamyi jardinero de Bolsón Cerrado).

¡¡Objetivo conseguido!! Los dos ñoños hobbits, que durante todo su viaje por la Tierra Media fueron inseparables hasta tal punto que ni Gollum ni mis orcos pudieron aislarlos, los separé y encapsulé en el camino de Cirith Ungol mediante la formación de sendos complejos de inclusión que eluyen a tiempos distintos en un cromatograma.

La triste Comunidad del Anillo

A diferencia de lo que hice con Gollum, al cual exterminé con mi enzima hidroperóxido liasa una vez que mis fuerzas iónicas lo habían atrapado, a mis queridos Frodo y Sam decidí mantenerlos encapsulados y enviarlos a mazmorras tal como hice en capítulos anteriores con Aragorn, Légolas, Gimli, Pippin o Merry.

Eso sí, antes recuperé el anillo que todos ustedes creen que se quemó en la Montaña del Destino en la meseta de Orodruin… el anillo por fin lo tiene su verdadero dueño, el genio de los mil nombres: Sauron el Señor Oscuro de Mordor, el Gran Ojo sin Párpado, Maia de Aulë discípulo de Melkor, el Enemigo Sin Nombre, Gorthaur «El Aborrecido«… el auténtico Señor de los Anillos.

Si quieren ver lo “monos” que quedaron Frodo y Sam una vez encapsulados por mi querida sulfated beta-cyclodextrin solamente tienen que echarle un vistazo a estas dos estructuras obtenidas mediante técnicas de modelado molecular y que fueron publicadas en un trabajo titulado “Chromatographic and spectroscopic studies on the chiral recognition of sulfated β-cyclodextrin as chiral mobile phase additive. Enantiomeric separation of a chiral amine” que se puede leer en la revista Journal of Chromatography A.

Modelado molecular de los enantiómeros Frodo y Sam separados y encapsulados en ciclodextrinas

Concluyo. Usando técnicas de cromatografía líquida, bien sea HPLC o UPLC, y a través de la fuerza iónica o de la encapsulación molecular, yo, el Señor Oscuro de Mordor, he logrado separar a los tres hobbits que tuvieron la osadía de atravesar la Tierra Media hasta llegar hasta la puerta de Mordor. El primero de ellos, el hidroperóxido Gollum, fue aniquilado y no cayó al fuego eterno como contó Tolkien. Los otros dos, los enantiómeros Frodo y Sam, fueron encapsulados en el interior de una de mis ciclodextrinas así que eso de que las águilas los rescataron es un cuento chino.

Tras 7 capítulos de “La Comunidad del Anillo y los ejércitos encapsulantes” han ido cayendo uno por uno casi todos los integrantes de esta banda de la Tierra Media. Aragorn, Légolas, Gimli, Frodo, Sam, Pippin, Merry y hasta Gollum han sido puestos a buen recaudo por mis tropas. Ya solo queda la batalla final contra mi gran contrincante. Prepárate Gandalf… tu final está cerca.

Jose

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Nota 1: Este post participa en el XIX Carnaval de la Química que se celebra en el fantástico blog “La estupidez es tremendamente más interesante”.

Nota 2. El resto de posts pertenecientes a la friki-serie “La Comunidad del Anillo y los ejércitos encapsulantes” pueden leerlos pinchando los siguientes enlaces:

1.-La noche que Gollum atrapó al más capullo de los antioxidantes

2.- El Bosque de Fangorn y la termodinámica de la encapsulación

3.- La empatía entre los Hobbits…y los animales modificados genéticamente del Reino de Mordor

4.-Légolas, el elfo que cayó en la trampa del arándano… y de la cromatografía líquida de alta resolución

5.- Gimli, el enano bioencapsulado por culpa de su mal olor

6.-La caída de Aragorn, el ácido linoleico encapsulado por un anillo de glucosa