¿Puede un detergente ayudar a identificar el aroma de una patata?

En el año 1993 un recién licenciado en Ciencias Químicas aterrizó en el Departamento de Bioquímica y Biología Molecular-A de la Universidad de Murcia. Meses más tarde envió un artículo científico a la revista Analytical Biochemistry. Ese envío tuvo dos peculiaridades que lo hacen diferente al resto de los trabajos que hoy componen su carrera profesional. La primera de ellas es que fue el primer artículo de su trayectoria por lo que aquel científico guarda un especial recuerdo de dicho trabajo. La segunda peculiaridad es que fue publicado sin que el editor de la revista decidiera hacer una sola corrección… cosa que jamás volvió a ocurrirle a aquel novato investigador en el resto de los artículos que publicó en los siguientes 20 años. Debido a que este mes se cumplen dos décadas de la publicación de aquel artículo hoy he decidido rendirle un homenaje al trabajo titulado “An octaethylene glycol monododecyl ether-based mixed micellar assay for lipoxygenase acting at neutral pH”… ¿bonito título eh?

Lipoxiganasa

Lo primero que le encomendaron a aquel recién licenciado nada más llegar al departamento fue que estudiara de cabo a rabo las propiedades de una enzima llamada lipoxigenasa. Esta molécula, perteneciente al grupo de las oxidorreductasas y que presenta un átomo de hierro en su centro activo, fue una de las primeras enzimas en ser cristalizada y se encuentra tanto en mamíferos como en plantas donde se la ha relacionado con los procesos de senescencia, germinación de semillas, cicatrización de heridas, formación de tubérculos, defensa ante el ataque de patógenos, etc.

Respecto a su actividad catalítica, lipoxigenasa es capaz de oxidar el sistema de dobles enlaces de diversos ácidos grasos poliinsaturados como es el caso de los ácidos linoleico, linolénico o araquidónico. Tanto los productos primarios de la oxidación de dichos ácidos grasos, como los metabolitos secundarios que se originan en la reacción catalizada por lipoxigenasa, están implicados en diferentes procesos relacionados tanto con los procesos de inflamación de tejidos celulares como con las características sensoriales de muchos alimentos.

Una vez que aquel novato ya conocía la vida y milagros de la que se iba a convertir en su enzima favorita, sus jefes le encargaron que estudiase el método tradicional de medida de lipoxigenasa. La tarea fue fácil. Una rápida revisión bibliográfica le mostró como para analizar la actividad lipoxigenasa sobre sus sustratos favoritos, los ácidos grasos poliinsaturados, se suele usar la espectrofotometría. Concretamente se puede monitorizar la desaparición de sustratos a una absorbancia de 210 nm o la aparición de los productos de la reacción (hidroperóxidos) a 234 nm. Sea de una forma u otra la reacción se sigue en una región del espectro electromagnético, el ultravioleta.

Cuando aquel pipiolo se había estudiado decenas de artículo científicos, los que se convertirían en sus directores de tesis le mandaron al laboratorio, le dieron una patata y le dijeron que detectara si ese tubérculo contenía en su interior la enzima lipoxigenasa. Lo primero que hizo aquel chaval fue aplicar un proceso ya establecido de extracción y purificación de la enzima lipoxigenasa de una fuente natural como la patata. Una vez realizada aquella ardua tarea, el resto del trabajo, medir la actividad enzimática, era coser y cantar… o eso creía él.

Según había podido leer en la bibliografía, lipoxigenasa de patata actúa a pleno rendimiento cuando el pH de la reacción es 6.3. Pues bien, el día que el joven científico intentó disolver los sustratos de la reacción en una disolución a ese valor de pH, se encontró una gran sorpresa: la disolución era turbia. ¿Y eso era importante? Por supuesto, en la región del UV donde absorben tanto los sustratos como los productos de la reacción la disolución debe estar totalmente transparente y cualquier rastro de turbidez impide la detección de la actividad enzimática en el espectrofotómetro.

En ese momento el bioquímico protagonista del post de hoy entendió el plan maquiavélico que sus jefes habían planeado. En realidad el problema no era extraer lipoxigenasa de patata sino diseñar un método de medida de actividad enzimática que permitiera determinar la actividad a pH 6.3 en la región del ultravioleta. ¿Y cuál era la única salida? Eliminar la turbidez del medio. Para hacerlo lo primero que debía saber aquel principiante era conocer cuál era el origen de dicha turbidez.

Como ya les conté en el post “La concentración micelar crítica…esa gran desconocida” los ácidos grasos poliinsaturados presentan un fenómeno de autoagregación dando lugar, a partir de una concentración llamada concentración micelar crítica (CMC), a estructuras de tipo micelar. Pues bien, esos agregados formados cuando la concentración de los ácidos grasos es superior a la CMC son los responsables de la turbidez del medio de reacción e impiden medir espectrofotométricamente la actividad enzimática en la región de 210-234 nm.

Cuando nuestro protagonista tuvo conocimiento de esta información que complicaba enormemente su trabajo intentó engañar a sus directores. Hábilmente propuso a sus jefes medir la actividad enzimática en la soja en vez de en la patata. La razón era que el pH óptimo de lipoxigenasa de soja es 9.0 (en patata 6.3) y a ese pH la CMC es mucho mayor, las micelas se forman mucho mas tarde y la turbidez tarda más en aparecer… pero sus mentores le dijeron que se dejara de truquitos, que la actividad lipoxigenasa de soja a pH 9.0 la había estudiado mucha gente y que debía de centrarse en la patata y en el pH 6.3. El chaval no tenia otra salida. Tenía que intentar como fuese resolver el problema de la turbidez.

Espectrofotómetro

Una opción que tenía era cambiar de técnica de medida. En lugar de usar un espectrofotómetro podía emplear un oxígrafo. Este aparato mide el consumo de oxígeno y es perfectamente útil para medir la actividad enzimática de una oxidorreductasa como es el caso de lipoxigenasa. Además, la turbidez no interfiere ya que no es un método óptico de análisis…pero sus jefes le dieron un ultimátum. O se te ocurre una idea para resolver espectrofotométricamente tu problema o te echamos del departamento.

En ese momento al novel bioquímico le vino una idea a la cabeza. La cuestión era evitar la formación de agregados de ácido linoleico, es decir, “solubilizar una grasa”. ¿Y cómo normalmente quitamos las grasas a la ropa sucia o a los platos usados? Pues con detergentes… y eso hizo muestro amigo, emplear un detergente para solubilizar al ácido linoleico para que no se formara turbidez.

Una de las aplicaciones más interesantes de los detergentes en bioquímica es la solubilización de enzimas y de sustratos pobremente solubles en agua. Otra posibilidad sería solubilizar los sustratos enzimáticos en disolventes orgánicos pero las enzimas perderían una parte muy importante de su actividad catalítica.

El detergente elegido por nuestro protagonista para no enfadar a sus jefes fue el éter monododecanol octaetilenglicol, un surfactante también conocido como C₁₂E₈. Este detergente, al combinarse con los ácidos grasos, forma lo que se denomina micela mixta (ácido graso/ C₁₂E₈) donde las partes apolares quedan en el interior de la micela y las polares se orientan hacia el exterior.

Micela mixta

A diferencia de otros detergentes, C₁₂E₈tiene la particularidad de que se conocen sus propiedades físico-químicas, no es desnaturalizante de enzimas, no interfiere con el ensayo enzimático y no presenta alta absorbancia en la zona del ultravioleta donde absorben los sustratos y productos de la reacción. Pero la propiedad más importante de C₁₂E₈es que, además de solubilizar fácilmente a los sustratos de lipoxigenasa a través de micelas mixtas, permite conocer en cada momento la cantidad de ácido graso que está disponible para ser oxidado por la enzima. Este hecho facilita enormemente la medida de la actividad lipoxigenasa permitiendo su caracterización cinética.

Para demostrarles el éxito de la formación de micelas mixtas para solubilizar ácidos grasos que puedan ser oxidados por la enzima lipoxigenasa de patata, me gustaría que observasen la siguiente imagen donde aparecen 4 gráficas.

La primera de ellas (a) corresponde a un espectro del detergente C₁₂E₈. Como pueden apreciar su absorción en la zona del UV es bajísima.

La segunda de ellas (b) corresponde al ácido linoleico solubilizado en C₁₂E_8.Se aprecia claramente el pico a 210 nm donde absorbe este sustrato de lipoxigenasa… pico que no se observaría si existiese turbidez en el medio.

La tercera de ellas (c) corresponde al ácido linoleico solubilizado en C12E8 una vez oxidado por lipoxigenasa y donde se contempla la aparición de un pico a 234 nm. Ese pico corresponde a la zona donde absorben los productos de lipoxigenasa sobre el ácido linoleico (llamados hidroperóxidos). Como se puede observar la presencia del detergente C₁₂E₈ permite que se pueda medir limpiamente la actividad enzimática al no existir turbidez en el medio.

La última gráfica (d) corresponde al espectro de absorción de otro detergente comúnmente empleado, el Tween-20. Si se dan cuenta el espectro se solapa con la zona de absorción de sustratos y productos de lipoxigenasa (al contrario que ocurre con la gráfica (a) que presenta muy baja absorción) por lo que el detergente Tween-20 no es útil para medir actividad lipoxigenasa.

Estimados lectores, aquel novato había solucionado el problema. El uso del detergente C₁₂E₈ le había permitido no solamente eliminar la turbidez del medio sino caracterizar la actividad lipoxigenasa de una patata.

Patatas

Y ustedes se preguntarán… ¿para qué sirvió el trabajo desarrollado por nuestro protagonista de hoy en colaboración con sus jefes?. Pues aquel estudio, seguido de un posterior trabajo en el que se identificaron los productos de la reacción, permitió conocer más acerca de los compuestos responsables del sabor y el aroma de las patatas ya que la oxidación de ácido grasos está implicada en la cascada de generación de compuestos volátiles de muchos alimentos.

Los resultados obtenidos fueron enviados a la revista Analytical Biochemistry y el editor no solamente quedó encantado sino que decidió que deberían publicarse sin la más mínima modificación. Ante tal acontecimiento el joven bioquímico, entusiasmado y más chulo que un ocho, les dijo a sus jefes: “Pues tampoco es tan difícil esto de publicar en una revista científica. Primer trabajo que envío y se lo han tragado sin rechistar. Esto de generar ciencia es coser y cantar”. Sus maestros se rieron diciéndole que rara vez volvería a ocurrir… y tenían razón. Desgraciadamente pará aquel novato investigador, hoy viejo científico, aquella hazaña no ha vuelto a repetirse. Todos sus artículos publicados, casi un centenar, han sido sometidos a revisión. Fue la suerte del principiante.

Y colorín colorado, esta historia totalmente real con la que he querido homenajear al artículo “An octaethylene glycol monododecyl ether-based mixed micellar assay for lipoxygenase acting at neutral pH” que vio la luz en 1994, se ha acabado. Transcurridos 20 años de la publicación de dicho trabajo aquel recién licenciado sigue manteniendo intacto su amor por la investigación. Además, desde hace unos años tiene otra pasión, la divulgación científica…y la lleva a cabo desde un blog. Se llama SCIENTIA.