El día que atrapé a Frodo, Sam, Merry y Pippin

No podía imaginar que el año 2016 acabaría con la mejor de las noticias. Los asquerosos Frodo, Sam , Pippin y Merry han sido aniquilados. Durante muchos tiempo estos cuatro hobbits pusieron en jaque todo mi imperio pero El Señor Oscuro de Mordor acaba de destrozarlos. Para ello he tenido que emplear a mi ejército de anillos (las ciclodextrinas) y a tres de mis herramientas científicas preferidas: la quiralidad, la cromatografía líquida en fase reversa y la química computacional. El método ha sido tan revolucionario que la revista Phytochemical Analysis lo ha publicado en su último número. Atentos a la jugada maestra.

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El metil jasmonato (MeJA) es un compuesto orgánico volátil de la familia de los jasmonatos que actúa como regulador del crecimiento de las plantas y al que se atribuyen efectos importantes sobre el desarrollo vegetal y sobre las respuestas a diferentes tipos de estrés ambiental. Entre las muchas aplicaciones del MeJA se encuentra su uso en cultivos celulares como elicitores con el objetivo de aumentar la producción de compuestos bioactivos de gran interés (estilbenos, aromas, clorofilas, etc.) que luego son empleados por la industria alimentaria, farmacéutica o cosmética.

Reconozco que no es la primera vez que el MeJA despierta la curiosidad del gran Sauron. En el post “El origen de los Uruk-Hai o el día que Sauron exterminó a sus Orcos con jasmonato para producir resveratrol les conté una historia tremenda. Estudios publicados por otros grupos de investigación mostraban que, por un lado, tanto mi ejército de ciclodextrinas como el MeJA eran capaces de incrementar la producción de ciertos metabolitos en cultivos celulares cuando se añaden de forma aislada. Otros estudios reflejaban que, al adicionar conjuntamente MeJA y ciclodextrinas, el aumento en la concentración de metabolitos era muy superior al incremento que se logra sumando la adición individual de ambos elicitores.

Pues bien, en aquel post les mostré como la razón de este comportamiento reside en que al añadir a un mismo medio de reacción simultáneamente ciclodextrinas y MeJA ambos compuestos reaccionan entre sí con resultados sorprendentes. La encapsulación del MeJA en el interior de ciclodextrinas produce un complejo de inclusión con una capacidad elicitora enorme.

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Ciclodextrinas

Pero la obra que inicié en aquel post no terminó de convencerme. Les cuento la razón. El MeJA presenta dos centros quirales en los carbonos 3 y 7 de la molécula (recordemos que la quiralidad es la propiedad de un objeto de no ser superponible con su imagen especular). La existencia de dos centros quirales en la estructura del MeJA implica que pueden existir cuatro configuraciones estereoisoméricas diferentes, es decir, cuatro isómeros que tienen la misma fórmula molecular y la misma secuencia de átomos enlazados pero difieren en la orientación tridimensional de dichos átomos en el espacio. Las diferentes orientaciones de los cuatro estereisómeros del MeJA dan lugar a propiedades biológicas y funcionales muy diferentes… incluyendo su capacidad elicitora.

En el caso del MeJA estas 4 configuraciones se denominan (3R,7S) (+)-7-epi-metil jasmonato; (3S,7S) (+)-metil jasmonato; (3R, 7R) (-)-metil jasmonato y (3S,7R) (-)-7-epi-metiljasmonato. Como se observa en la siguiente imagen los cuatro estereosiómeros del MeJA guardan un gran “parecido físico” con los cuatro hobbits. A falta de la confirmación experimental (-) epiMeJA y (+) epiMeJA se parecen mucho a Merry y Pippin y (-) MeJA y (+)MeJA a Sam y Frodo. Blanco y en botella.

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¿Y dónde está el problema de los estereoisómeros del MeJA? En que las principales casas comerciales suministran a los científicos la mezcla de los 4 estereoisómeros ya que no han sido capaces de aislarlos individualmente. Es cierto que diversos grupos han propuesto métodos como la resolución enzimática, el uso de columnas quirales o el tratamiento previo de las muestras para la separación de los estereoisómeros. Sin embargo, los métodos propuestos no solo son largos de ejecutar y muy costosos. Por ello es necesario disponer de un método rápido y barato de separación que permita emplear cada estereoisómero individualmente. Así, cada científico empleará el que más le convenga sin necesidad de usar la mezcla. Todo esto, además, me permitiría encapsular a los 4 hobbits rompiendo la magia de la Tierra Media. Jugada maestra.

Para seleccionar al agente encapsulante más eficaz para separar los estereoisómeros del MeJA yo, el Señor Oscuro de Mordor, llamé a mis tropas más poderosas: las ciclodextrinas alfa (6 unidades de glucosa); beta (7 unidades de glucosa); gamma (6 unidades de glucosa); metil-beta (7 unidades de glucosa y un grupo metilo); hidroxipropil-beta (7 unidades de glucosa y un grupo hidroxipropilo) e hidroxipropil-etil (7 unidades de glucosa y un grupo etilo). Si quieren saber cómo funciona una ciclodextrina lean “La reina de la encapsulación molecular “ y si desean saber cómo se forman no se pierdan El comienzo de una Edad, la historia de cómo Sauron creó sus ciclodextrinas”.

Una vez que se presentaron en la Torre de Barad-dûr les comuniqué a estas ciclodextrinas que debían usar la cromatografía líquida de alta eficacia en fase reversa (RP-HPLC) para atrapar al MeJA. ¿Saben en qué consiste esta técnica que tanto se emplea en bioquímica o química analítica?

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El HPLC es un tipo de cromatografía en columna utilizada, principalmente, para separar los componentes de una mezcla basándose en diferentes tipos de interacciones químicas entre las sustancias analizadas y la columna cromatográfica. La muestra a analizar pasa por la columna cromatográfica a través de la fase estacionaria (normalmente llamada columna) mediante el bombeo de líquido (fase móvil) a alta presión a través de la columna. La muestra a analizar es introducida en pequeñas cantidades y sus componentes se retrasan diferencialmente dependiendo de las interacciones químicas o físicas con la fase estacionaria a medida que adelantan por la columna.

El grado de retención de los componentes de la muestra depende de la naturaleza del compuesto, de la composición de la fase estacionaria y de la fase móvil. El tiempo que tarda un compuesto a ser eluído de la columna se denomina tiempo de retención y se considera una propiedad identificativa característica de un compuesto en una determinada fase móvil y estacionaria.

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Ejemplo de separación por HPLC. Fuente: Biokipedia.

Cuando los integrantes de una mezcla son muy diferentes la separación cromatográfica es relativamente sencilla ya que dichos compuestos interaccionan de forma muy diferente con la fase estacionaria, siendo los tiempos de retención muy distintos. Sin embargo, en el caso de los estereoisómeros del MeJA la similitud estructural es tan grande que es muy difícil separarlos usando la técnica de HPLC tradicional … pero nada es imposible para Sauron.

Tras mucho cavilar di con la solución ideal: introducir mis ciclodextrinas en la fase móvil. La gran especificidad de la cavidad interna de las ciclodextrinas permitiría separar compuestos estructuralmente muy parecidos…incluidos los estereoisómeros del MeJA. Al pasar la mezcla del MeJA por la fase móvil, lso 4 estereoisómeros se retendrían de forma diferente en la cavidad interna y se separarían.

Pero el uso de la técnica tradicional de RP-HPLC para separar compuestos lipofílicos como es el caso del MeJA presenta otro grave problema: el elevado tiempo de análisis necesario. La presencia de las ciclodextrinas en la fase móvil también solucionaría este inconveniente. En el caso de que estos agentes encapsulantes pudieran atraparlo en su interior, el MeJA aumentaría su solubilidad aparente al quedar encapsulada su estructura lipofílica en el interior de la ciclodextrina. ¿Y esto en qué se traduciría? En que los tiempos de análisis serían muchos más cortos. Sin embargo, si las ciclodextrinas del gran Sauron no eran capaces de encapsular al MeJA el tiempo de análisis de la mezcla de los 4 hobbits seguiría siendo alto y no solo mi hipótesis de que la ciclodextrina atrapa al MeJA no se corroboraría, sino que los estereoisómeros no se separarían y, por tanto, los hobbits no serían exterminados. Un desastre que no podía permitirme.

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Tocaba pasar de la teoría a la práctica. Introduje concentraciones crecientes de ciclodextrinas en la fase móvil y esperé la respuesta del HPLC al inyectar la muestra formada por los 4 estereoisómeros del MeJA. Al principio todo salió a pedir de boca. En la anterior imagen se puede observar como el tiempo de retención del MeJA disminuyó conforme aumentaba la presencia de ciclodextrinas en el medio… lo que indicaba que mis ciclodextrinas eran capaces de comerse a la mezcla de hobbits. Ajustando los datos de los tiempos de retención obtenidos en distintas condiciones experimentales a diferentes modelos matemáticos pude obtener los datos que necesitaba.

En la siguiente tabla se muestran las constantes de encapsulación entre el MeJA y diferentes tipos de ciclodextrinas. Como se observa, mi agente Metil-beta-CD fue la que mejor funcionó para atrapar al MeJA… su constante de unión era la más alta. También se refleja que la estequiometría de la interacción es siempre 1:1. Es decir, que una molécula de ciclodextrina atrapa una molécula de MeJA.

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Pero no es oro todo lo que reluce en Mordor. Si se fijan atentamente en el cromatograma anterior habrán sacado una conclusión negativa: Metil-beta-CD atrapa bien a la mezcla de estereoisómeros del MeJA pero no es capaz de separar los 4 estereoisómeros. No aparecen 4 picos claramente definidos. Tocaba optimizar las condiciones de medida o mi plan de encapsular a Frodo, Sam, Pippin y Merry sería un fracaso.

Me encerré de nuevo en los laboratorios de la Torre de Barad-dûr y cambié las condiciones de reacción. Probé fases móviles con diferente concentración de disolvente orgánico (20-40% de metanol); ensayé con distintas cantidades de Metil-beta-CD (0-16 mM), amplié el rango de temperatura (de 5 to 60 °C), usé diferentes tipos de fase estacionaria y de flujo… hasta que una oscura noche en Mordor llegó el momento que tanto ansiaba.

Empleando una concentración de metanol en la fase móvil del 20%, una temperatura de 45º C, una concentración de Metil-beta-CD de 16 mM, una fase estacionaria formada por una columna C18 de 250 mm y un flujo 1.25 mL/min logré separar a los 4 hobbits, es decir, a los isómeros del MeJA. En la siguiente imagen tienen mi obra de arte. Un cromatograma con 4 picos diferentes.

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¿Había concluido? No. Faltaba lo más importante. Los 4 estereisómeros estaban separados pero aun no había identificado cuál era cada uno. ¿Qué pico correspondía a cada uno de ellos? Para saberlo lo primero que hice fue recurrir a la química computacional y al cribado virtual… cuyos padres fueron el investigador austríaco Martin Karplus, al sudafricano Michael Levitt y al israelí Arieh Warshel, galardonados con el Premio Nobel de Química 2013.

El cribado virtual es el uso de herramientas de modelado molecular o química computacional para cribar in-silico (vía simulación computacional) una librería que contiene información estructural sobre gran cantidad de ligandos (incluso decenas de millones de ellos). Un correcto cribado nos permitirá encontrar entre todos los componentes de dicha librería, y sin necesidad de ir probando uno por uno en el laboratorio, cuáles son los ligandos óptimos.

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Galardonados con el Premio Nobel de Química 2013

Para realizar cribado virtual podemos usar muchas técnicas distintas, desde las más rápidas e imprecisas, tales como farmacóforos, como las de mediana precisión (docking), como las de precisión alta (dinámica molecular) y por último las de muy alta precisión (métodos cuánticos). Analizando la estructura de los estereoisómeros del MeJA decidí que el docking molecular era suficiente para identificarlos. Como imaginaran en mi despacho de la Torre de Barad-dûr dispongo de potentes ordenadores por lo que no tuve problema para hacer las simulaciones correspondientes y obtener las puntuaciones que reflejaban la capacidad de Metil-beta-ciclodextrina para encapsular cada estereosiómero del MeJA .

Los resultados fueron claros: el pico 1 corresponde al (-) epiMeJA; el pico 2 al (-) MeJA; el pico 3 al (+)MeJA y el pico 4 al (+) epiMeJA. Observando la estructura del los 4 estereoisómeros, la altura de los picos y la importancia que en la trilogía de Tolkien tienen los 4 hobbits, la identificación fue evidente: (-) epiMeJA y (+) epiMeJA, los picos más pequeños, corresponden a Merry y Pippin, respectivamente. (-) MeJA es Sam y el mayor de todos los picos, (+)MeJA, correspondía al Hobbit más influyente en la historia de la Tierra Media: el papanatas de Frodo.

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Los 4 estereisómeros del MeJA: Frodo, Sam, Merry y Pippin

Para no dejar lugar a la duda de que la identificación era correcta también empleé una muestra de aceite esencial de romero ya que está formado principalmente por (-) MeJA según la literatura científica. Una coinyección en el HPLC de mi mezcla de MeJA junto con unos microlitros de aceite esencial de romero confirmó los resultados del HPLC y del docking molecular. Los 4 hobbits estaban bien identificados.

En la siguiente imagen les muestro las imágenes que predice la química computacional acerca de los complejos formados por los 4 estereoisómeros del MeJA y la Metil-beta-CD… una preciosidad donde las líneas discontinuas en amarillo representan los puentes de hidrogeno entre el agente encapsulante y las moléculas huésped y que demuestra que los malditos Frodo, Sam, Merry y Pippin están atrapados en Mordor y no tocándome las narices por toda la Tierra Media.

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Estimados lectores, como les dije al principio de este post la revista Phytochemical Analysis ha decidido que esta maravillosa obra de Sauron debía ver la luz y lo acaba de publicar en su último número. Es la primera vez que se logra separar a los 4 estereosiómeros del MeJA usando un método rápido y barato. Esto permitirá a las empresas que suministran productos químicos no tener que vender la mezcla de MeJA como viene haciendo hasta ahora y, a los científicos, usar el estereoisómero más apropiado según el objetivo que se desee alcanzar.

Aquí les dejo una maravillo imagen que resume todo el proceso descrito en este post y que ha sido la que ha convencido al Phytochemical Analysis.

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Queridos hobbits, espero que paséis una Feliz Navidad en mis mazmorras encapsulantes pero jamás olvidéis que vuestra miseria es tan grande como el Reino de Mordor.

Sauron

Bibliografía: Matencio, A; Bermejo, M;García-Carmona, F. and López-Nicolás, J.M.. Separating and Identifying the Four Stereoisomers of Methyl Jasmonate by RP-HPLC and using Cyclodextrins in a Novel Way. Phytochem Anal. 2016. doi: 10.1002/pca.2654

Nota: En este enlace pueden leer todos artículos publicados sobre “La Ciencia de EL Señor de los Anillos”.

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5 respuestas a El día que atrapé a Frodo, Sam, Merry y Pippin

  1. raguadog dijo:

    La divulgación científica puede antojarse fácil cuando hablamos de vitaminas, relaciones sexuales, restos arqueológicos y otros temas que suscitan interés por sí solos en personas ajenas a estudios de ciencias. Pero el uso de ciclodextrinas para separar en un cromatograma los picos característicos de cuatro estereoisómeros de un mismo compuesto… Cualquier otro día habría pensado que la divulgación tiene sus límites. Pero… ¡hoy no es ese día! ¡En este día lucharemos!

  2. tramullas dijo:

    Espectacular, enhorabuena (y soy de letras puras con latín y griego ;¡:-)

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