He de reconocer que yo, el Señor Oscuro de Mordor, he vivido engañado mucho tiempo. Intentando justificar con argumentos científicos mi debilidad por el vino, he dedicado mucho tiempo a divulgar las propiedades beneficiosas del resveratrol, ese compuesto mediático de la familia de los estilbenos presente en la uva tinta y que aun no ha sido capaz de demostrar ninguna de las propiedades beneficiosas en humanos que algunos intentan atribuirle. Sin embargo, aun tengo depositadas grandes esperanzas en esta molécula por lo que como verdadero Señor de los Anillos sigo empeñado en estudiar la manera de producir mayores cantidades de resveratrol en la Tierras de Mordor.

En el post de hoy vuestro amo, el gran Sauron, os voy a contar qué estrategia es la correcta para aumentar los niveles de resveratrol en cultivos celulares. Para ello me apoyaré en la química analítica, en la microencapsulación molecular y en la química computacional recién galardonada con el Premio Nobel de Química… y ya de paso resolveré dos de los grandes enigmas de la Tierra Media: cómo desaparecieron los Orcos y la verdad del nacimiento de los temibles Uruk-Hai. Agárrense que vienen curvas.

Durante mucho tiempo desde la Torre de Barad-dûr situada en una estribación de las Ered Lithui (‘montañas de ceniza’), al norte de Mordor, he seguido con gran interés los avances que un grupo de científicos de las universidades de Murcia y Alicante, por el que siento un gran respeto y admiración, han hecho en la producción de compuestos bioactivos de alto interés biológico como es el caso del resveratrol.

Al final de la Primera Edad del Sol la cantidad de uva en la Tierra Media bajó de forma preocupante debido al abuso que los borrachos Hobbits realizaban del vino, lo que dificultaba el proceso de obtención del resveratrol que tan de moda se ha puesto en la industria de los complementos alimenticios y de la cosmética. Había que encontrar una manera para incrementar las cantidades de este compuesto.

Entre las tradicionales soluciones a ese problema se encuentran la transferencia del gen responsable de la enzima que sintetiza el resveratrol (resveratrol sintasa) a una planta que no produce resveratrol de forma natural o el tratar plantas enteras de vid con cloruro de aluminio para aumentar el contenido en resveratrol. Sin embargo, el grupo de investigación anteriormente citado escogió otra alternativa: el uso conjunto de diferentes elicitadores (sustancias que elevan la producción de otros metabolitos) para aumentar la eficacia de distintas células y así producir resveratrol extracelular.

¿Y se imaginan ustedes qué elicitadores emplearon? Pues como no podía ser de otra forma… a los patéticos Orcos y a las nuevas tropas del Señor Oscuro de Mordor: las Ciclodextrinas. Atentos a lo ocurrido que no tiene desperdicio.

Metil jasmonato

Los horribles Orcos, que fueron mi ejército preferido hasta que fueron derrotados por la triste Comunidad del Anillo, siempre me han recordado, por su mal olor y su servilismo, al metil jasmonato, un compuesto orgánico volátil de la familia de los jasmonatos que actúa como regulador del crecimiento de las plantas y al que se atribuyen efectos importantes sobre el desarrollo vegetal y sobre las respuestas a diferentes tipos de estrés ambiental.

Entre las muchas aplicaciones del metil jasmonato se encuentra su uso en cultivos celulares con el objetivo de aumentar la producción de compuestos bioactivos de gran interés como es el caso del resveratrol.

Sin embargo, el grupo de investigación magistralmente dirigido por los doctores R. Brú y M.A.Pedreño demostró como hay ocasiones donde los Orcos (digo el jasmonato) no tienen la suficiente capacidad para aumentar significativamente la producción de resveratrol extracelular a partir de células capaces de sintetizar este compuesto… así que llamaron a las Ciclodextrinas, compuestos que también han sido empleados habitualmente como elicitores, para que les echaran una mano.

¿Y que ocurrió en esa colaboración? En la siguiente imagen pueden observar lo que sorprendentemente sucedió cuando en las Tierras de Mordor se unieron Orcos (jasmonato) y Ciclodextrinas. Muy atentos:

Producción de trans-resveratrol por unidad de volumen de medio extracelular (g/litro de medio) de Vitis vinifera Monastrell a lo largo de 288 horas de incubación.

Analizando el efecto individual de los dos elicitores empleados (Orcos y Ciclodextrinas) se puede observar como el metil jasmonato no ayudó mucho a la producción del resveratrol. Por otra parte en la imagen se ve como las Ciclodextrinas sí que actuaban como elicitores favoreciendo el incremento del resveratrol en el medio de cultivo. Sin embargo, la gran sorpresa llegó cuando se observó lo que ocurrió al adicionar conjuntamente Orcos y Ciclodextrinas. Si se fijan bien en la anterior gráfica podrán observar como el resveratrol que se obtiene gracias a la presencia simultánea de metil jasmonato y Ciclodextrinas en el medio de reacción es muy superior al resveratrol que se logra sumando el obtenido por la adición individual de ambos elicitores.

El trabajo realizado por las universidades de Alicante y Murcia (y que se está empleando con gran éxito para la producción de otros metabolitos bajo diferentes patentes) había dado sus frutos. La producción de resveratrol aumentó espectacularmente. Sin embargo, varias preguntas quedaban en el aire.

¿Qué estaba pasando? ¿Por qué Orcos y Ciclodextrinas al trabajar de forma conjunta lograban mejores resultados en el campo de batalla que si sumábamos sus esfuerzos individuales? ¿Se ayudaban unos a otros? ¿Era un efecto sinérgico?

Nada de eso. En realidad todo era un plan que yo, el Gran Ojo sin Párpado, había diseñado desde la Torre de Barad-dûr para exterminar definitivamente a mis Orcos tras su triste papel en la Batalla de los Campos del Pelennor. Mi estrategia era la siguiente. Una vez comprobado que el metil jasmonato (Orcos) no era capaz de estimular significativamente la producción de resveratrol, mis Ciclodextrinas debían bajar al campo de batalla. Allí les ordené fingir ser amigas de los Orcos y, que a la más mínima, debían hacerlos desaparecer encapsulándolos en su interior. El ”nuevo ser” formado por una ciclodextrina con una molécula de metil jasmonato en su interior sería el responsable de producir resveratrol en cantidades mucho mayores que si Orcos y Ciclodextrinas trabajaban individualmente.

¿Y todo este maquiavélico plan era científicamente posible? Hasta hace unos días nadie había demostrado que las Ciclodextrinas podían encapsular al metal jasmonato en su interior. Todo el mundo hablaba de que trabajaban en cooperación… así que a Sauron le tocaba demostrarle a la comunidad científica que mis Ciclodextrinas tenían capacidad de zamparse un Orco. ¿Cómo lo hice? Empleando la encapsulación molecular, la cromatografía líquida de alta resolución en fase reversa (RP-HPLC) y la química computacional. Veamos.

HPLC

El uso de la técnica tradicional de RP-HPLC para analizar compuestos mayoritariamente lipofílicos  presentaba un grave problema: el elevado tiempo de análisis necesario. Una posible solución a este inconveniente era introducir a mis nuevas tropas, las Ciclodextrinas, en la fase móvil del sistema cromatográfico. En el caso de que estos agentes encapsulantes pudieran atraparlo en su interior, el metil jasmonato aumentaría su solubilidad aparente al quedar encapsulada su estructura lipofílica en el interior de la ciclodextrina.

¿Y esto en qué se traduciría? En que los tiempos de análisis serían muchos más cortos. Sin embargo, si las Ciclodextrinas del gran Sauron no eran capaces de encapsular al metil jasmonato, el tiempo de análisis de este Orco seguiría siendo alto y no solo mi hipótesis de que la Ciclodextrina se zampa al metil jasmonato no se corroboraría, sino que los Orcos no serán exterminados… ¿me siguen?

Pues bien, en la siguiente imagen se puede observar como, al usar RP-HPLC como técnica cromatográfica, el tiempo de retención del metil jasmonato disminuyó conforme se aumentaba la presencia de Ciclodextrinas en el medio… lo que indicaba que mis Ciclodextrinas eran capaces de comerse a los tristes Orcos. La guerra interna entre mis dos tropas (Orcos y Ciclodextrinas) había comenzado… y el destrozo que las últimas hicieron en las filas de las primeras fue épico.

De entre todas las Ciclodextrinas que se encuentran en la naturaleza (alfa, beta y gamma), aquella formada por 7 unidades de glucosa (beta-ciclodextrina) fue la más efectiva para encapsular Orcos. Sin embargo, esa no fue la más potente de todas mis Ciclodextrinas en su afán por comerse los Orcos. HP-β-CD, una ciclodextrina que sinteticé químicamente en la Torre de Barad-dûr, destrozó al ejercito de estas miserables y deformes criaturas usadas también como soldados y secuaces por Melkor y Saruman… pero esto no acaba aquí.

No hay que perder de vista que el objetivo principal  de mi plan no era solo demostrar que las Ciclodextrinas podían introducir en su interior al Orco metil jasmonato, sino caracterizar perfectamente al producto resultante de dicha encapsulación para su posterior uso en la producción de grandes cantidades de resveratrol.

Por este motivo el siguiente paso en mi estrategia fue estudiar el efecto de diferentes condiciones físico-químicas, como pH y temperatura, en el proceso de encapsulación. Como era esperable, la fuerza de encapsulación no fue dependiente del pH del medio. ¿Por qué? Porque como pueden comprobar en la imagen la estructura del metil jasmonato no tiene ningún grupo capaz de ser modificado significativamente por el pH.

Sin embargo, la temperatura del medio sí que afectó al proceso por el cual las Ciclodextrinas exterminaban a los Orcos. A menor temperatura, mayor fuerza de encapsulación…el frío de Mordor terminó por matar a los Orcos y el cálculo de los principales parámetros termodinámicos del sistema determinados gracias a la ecuación de Van´t Hoff me ayudó a terminar mi tarea.

Como se pueden imaginar el hecho de haber atrapado a los Orcos en el interior de mis ejércitos encapsulantes, y así haber limitado su capacidad de movimiento, dio lugar a un aumento del orden deseado en las Tierras de Mordor. Esto se tradujo en disminución en la entropía del sistema (-33.72 J mol-1K^-1), entendiendo esta coloquialmente como una forma de medir el desorden de un sistema.

Además, y para que no quedara Orco con vida, decidí quemar todo el medio de cultivo. Para ello solamente tuve que calcular, empleando la citada ecuación de Van´t Hoff, la entalpía del sistema. El valor calculado, -19.66 kJmol^-1, fue demoledor para los Orcos que no habían sido encapsulados e intentaban escapar. Una variación de entalpía negativa implica que la reacción que se ha producido es exotérmica o, en otras palabras, desprende calor… el justo y necesario para que ardieran los Orcos que habían querido huir de mis Ciclodextrinas.

Mi gran obra de arte estaba prácticamente concluida. Había resuelto las grandes preguntas planteadas al principio del post. El incremento de resveratrol debido a la presencia conjunta en los medios de cultivo de dos elicitores (mi ejército Ciclodextrinas y el metil jasmonato) podría ser debido a la encapsulación de este último en el interior de las tropas encapsulantes de manera que el producto resultante tendría mayor poder elicitor que sus dos componentes por separado. El triunfo era total. Aunque los borrachos Hobbits habían acabado con todo el vino y la uva de mis tierras, yo volvía a tener grandes cantidades de resveratrol a mi disposición.

En teoría la tarea estaba concluida.… pero antes de retirarme a mi fortaleza tenía una gran sorpresa reservada para elfos, enanos, hombres, árboles, hobbits y demás habitantes de la Tierra Media.

Como bien conocen los amantes de la obra de Tolkien, por el nombre de Uruk-Hai se conoce al auténtico cuerpo de élite de Sauron, un grupo de Orcos mejorados, seleccionados de entre los más aptos, y que poseían cualidades especiales con respecto a los demás Orcos: soportaban sin mayores problemas la luz del sol, además de ser más altos y proporcionados.

Sin embargo, el origen de los Uruk-Hai siempre ha sido un gran misterio. Hace unos días realicé la siguiente pregunta a los seguidores de mi cuenta de twitter. ¿De donde salieron los Uruk-Hai? Hubo respuestas de todo tipo. Que si eran fruto de cruces entre Orcos y dunelinos realizados por Saruman; que si procedían de un cruce de Orcos y elfos según lo que dice la Wikipedia; que si era Orcos genéticamente mejorados por Sauron… pero nadie acertó por lo que hoy voy a descubrir la verdadera procedencia de los Uruk-Hai.

Complejo de inclusión

Desde el punto de vista científico el producto resultante de la encapsulación molecular del metil jasmonato (Orco) por mis Ciclodextrinas capaz de aumentar la cantidad de resveratrol en un medio de cultivo recibe el nombre de complejo de inclusión. Pues bien, este complejo de inclusión, que como he demostrado hoy tiene un poder elicitor muy superior al que presentan los Orcos o las Ciclodextrinas individualmente, es el verdadero Uruk-Hai, mi terrible guerrero de piel negra y de un rojo oscuro, ojos grandes y amarillos, y cabellos largos y negros… lo que han leído.

¿Pero cómo es un Uruk-Hai por dentro?

Una vez que las Ciclodextrinas encapsulan al Orco en su interior se producen una serie de interacciones moleculares entre el agente encapsulante y la molécula huésped que logré determinar empleando estudios de modelado molecular procedentes de la química computacional… esa imprescindible rama de la química moderna que acaba de ser premiada con el Premio Nobel de esta disciplina científica.

Para conocer la estructura interior de los Uruk-Hai (también llamados complejos de inclusión entre metil jasmonato y ciclodextrinas) solamente tienen que observar estas bonitas figuras que nos ofrece la química computacional. ¿Preciosas eh?.

Concluyo. Como habrán podido ver no me ando con chiquitas. Si un ejército me defrauda, como es el caso de los Orcos, no tengo ningún inconveniente en aniquilarlo gracias a mis tropas encapsulantes. Si además con ello consigo justificar el aumento de la producción de resveratrol gracias a la formación de Uruk-Hais, mejor que mejor… y si encima estos resultados convencen al consejo editorial de la revista Journal of Agricultural and Food Chemistry y lo publican en el último número del año 2013 alegrándome la Navidad, el triunfo de Sauron es total. Qué grande soy.

Jose

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*Los anteriores 9 capítulos de la serie “La comunidad del anillo y los ejércitos encapsulantes” pueden leerlos pinchando en este enlace.

* Physicochemical and thermodynamic characterization of the encapsulation of methyl jasmonate by natural and modified cyclodextrins using reversed-phase high-pressure liquid chromatography. López-Nicolás JM, Escorial Camps M, Pérez-Sánchez H, García-Carmona F. J Agric Food Chem. 2013, 27;61(47):11347-54.

* Este post participa en la edición número 30 del carnaval de la Química que este mes organiza el blog «Activa tu neurona» y en la  XXVII Edición del Carnaval de Biología que organiza uno de mis blogs de referencia: «La aventura de la Ciencia».