Enzimas y sustratos…marquesas y plebeyos

Unas marquesas. Así defino a las enzimas cada vez que hablo de ellas ya que solamente son capaces de hacer correctamente su trabajo cuando se rodean de las condiciones óptimas de pH, temperatura y fuerza iónica. Eso sí, cuando arrancan no hay quien las pare… o tal vez sí.

Sin duda alguna, las grandes protagonistas de una reacción enzimática son estas moléculas de naturaleza proteica capaces de catalizar diferentes tipos de reacciones implicadas en múltiples procesos . Sin embargo, y a pesar de que a veces pasa desapercibido debido a la grandiosidad de su compañera de reparto, en una reacción enzimática no hay que perder de vista al otro gran protagonista de la catálisis, el sustrato de la misma. Veamos.

Uno de los grandes problemas que se producen en la investigación básica en enzimología es centrarse únicamente en la activación o inactivación de las enzimas por pH, temperatura o fuerza iónica, dejando a un lado cómo afectan las variaciones de esos parámetros a la naturaleza de los sustratos enzimáticos, los grandes plebeyos de la corte.

En el caso que hoy nos incumbe, el efecto del pH sobre la catálisis enzimática, es cierto que las enzimas poseen grupos químicos ionizables (carboxilos -COOH; amino -NH2; tiol -SH; imidazol, etc.) en las cadenas laterales de sus aminoácidos que, según el pH del medio, pueden tener carga eléctrica positiva, negativa o neutra. Como la conformación de las proteínas depende, en parte, de sus cargas eléctricas, habrá un pH llamado óptimo en el cual la conformación será la más adecuada para la actividad catalítica. Además, desviaciones de pocas décimas por encima o por debajo del pH óptimo pueden afectar drásticamente su actividad hasta el punto que ligeros cambios del pH pueden provocar la desnaturalización de la proteína.

Debido a ello, todo trabajo que aborde la caracterización de una actividad enzimática debe llevar un apartado donde se pueda apreciar la típica campana que muestra el efecto del pH sobre la actividad catalítica. De esta forma podremos conocer cuáles son las condiciones del medio adecuadas para poder seguir con el estudio enzimático.

Sin embargo, tanta obsesión en estudiar los efectos que esas variables producen en la enzima, y que pueden llegar a modificar la catálisis enzimática, da lugar a que algunas ocasiones pase desapercibido un hecho que puede ser crucial para el desarrollo de la reacción enzimática… el efecto que dichos factores puede llegar a producir sobre la estructura del sustrato de la reacción y que puede tener la misma o más incidencia sobre la reacción estudiada.

Veamos un curioso caso que se me presentó hace poco tiempo y que dio mucho de sí, el de la oxidación de mi querido resveratrol, el príncipe de las moléculas de la eterna juventud, por lipoxigenasa (LOX), una enzima perteneciente al grupo de las oxidorreductasas y que presenta un átomo de hierro situado en su centro activo.

Al evaluar el efecto del pH sobre la actividad catalítica de LOX cuando ésta emplea como sustrato el resveratrol ,se observó una campana semejante a la descrita anteriormente y con un pH óptimo alrededor de 8.5 lo que en un primer momento condujo a la sospecha de que a pHs alejados de este valor la estructura de la enzima empezaba a ser alterada… pero no responsabilicemos tan pronto al papel que el pH desempeña sobre la estructura de la enzima y dirijamos la mirada al sustrato de la reacción, el resveratrol.

Como podemos observar en la imagen previa, este estilbeno presenta tres grupos ionizables correspondientes a sus tres grupos hidroxilos que pueden ser fácilmente deprotonados al alcanzar los tres pKa de esta molécula, es decir, los valores de pH a los cuales la fracción no ionizada de un compuesto corresponde al 50% y el otro 50% está ionizada.

Este hecho hizo sospechar que la estructura del sustrato de la reacción enzimática podía ser fácilmente alterable por cambios en el pH del medio y, por tanto, existían muchas posibilidades de que influyera en la reacción enzimática más allá de posibles cambios en la estructura de la enzima. Por ello, el primer paso que dimos en nuestra investigación fue averiguar el valor de los tres pKa del resveratrol mediante técnicas de absorbancia y fluorescencia.

En la anterior figura podrán comprobar que el espectro de absorbancia del resveratrol presenta significantes diferencias según el pH, observándose un desplazamiento batocrómico de dicho espectro hace longitudes de onda superiores conforme basificamos el medio de reacción. Sin embargo, a pHs inferiores a 8.0 el espectro permanecía prácticamente estable.

La representación de los cambios en la longitud de onda máxima del espectro del resveratrol frente al pH nos sirvió para determinar los dos primeros pKa de este antioxidante, estableciéndose valores de de 8.8 para el hidroxilo situado en posición (en el extremo derecho de la Figura A) y 9.8 para el situado en posición 5´o 3´ (en el extremo izquierdo arriba).

Sin embargo, mediante la técnica de absorbancia no pudimos determinar el valor del tercer pKa del resveratrol por lo que tuvimos que recurrir, aprovechándonos de la fluorescencia intrínseca de los estilbenos, a la espectroscopía de fluorescencia, bastante más sensible que la absorbancia. Repitiendo los mismos experimentos realizados anteriormente a diferentes pHs, pero determinando en esta ocasión los espectros de emisión y excitación de fluorescencia de este estilbeno en zonas ácidas, neutras y alcalinas, pudimos observar cómo tanto la longitud de onda máxima de excitación como la intensidad del resveratrol, se veían afectadas por la protonación/deprotonación de esta molécula.

Mediante los resultados obtenidos uniendo las técnicas de absorbancia y fluorescencia se logró determinar el tercer pKa del resveratrol, es decir, el valor de pH el cual una vez superado los tres grupos hidroxilo de esta molécula se encuentran “prácticamente” deprotonados. Dicho valor fue de 11.4 para el hidroxilo situado en posición 3´ o 5´ (en el extremo izquierdo debajo de las estructuras anteriormente presentadas.)

Resumiendo: a valores de pH por debajo de 8.8 (primer pKa) el resveratrol presenta una estructura protonada con sus 3 grupos hidroxilo intactos. Si el pH del medio de reacción se encuentra entre 8.8 y 9.8 uno de los grupos hidroxilo, el situado en posición 4´, pierde su protón. Si seguimos basificando el medio, y nos encontramos en una región cuyo pH esté entre 9.8 y 11.4, el siguiente grupo hidroxilo sería también deprotonado y, por último, a valores de pH superiores a 11.4 el resveratrol no posee ningún grupo hidroxilo intacto (salvo un pequeño tanto por ciento del que hablaremos otro día).

Lipoxigenasa

Lipoxigenasa

Hasta aquí todo claro (o eso espero) pero…  ¿sirve para algo conocer los valores de los tres pKa del resveratrol? Por supuesto. En un post anterior ya hablamos de las implicaciones sobre la salud de estos descubrimientos, desvelando que un grupo de investigación eslovaco perteneciente al Cancer Research Institute descubrió que todas las propiedades saludables del resveratrol, el elixir de la eterna juventud, residen en el hidroxilo situado en posición 4´. En otras palabras, a pHs superiores al primer pKa de este estilbeno (pHs mayores que 8.8), el resveratrol no sirve para casi nada.

Pero en el caso que hoy nos ocupa de la posible oxidación del resveratrol por la enzima lipoxigenasa a diferentes pHs… ¿qué importancia tienen los resultados obtenidos sobre los tres pKas de este estilbeno y que fueron publicados en un artículo de la revista Journal of Agricultural and Food Chemistry titulado “Aggregation state and pKa values of (E)-resveratrol as determined by fluorescence spectroscopy and UV-visible absorption”? Muchísimo.

En la siguiente figura podemos observar el efecto del pH del medio de reacción sobre la actividad catalítica de LOX cuando se emplea resveratrol como sustrato. Como se puede comprobar la forma de la gráfica es muy similar a las típicas campanas de pH anteriormente descritas que suelen indicar el efecto de la acidez/basicidad del medio sobre la estructura de la enzima… pero en este caso va a ser que no es la enzima, o no solo ella, la responsable de tal comportamiento.

Si se fijan podrán contemplar que la oxidación por LOX de nuestro príncipe de la eterna juventud, el resveratrol, es totalmente dependiente del estado de protonación de este estilbeno y, por tanto, de los tres pKa descritos anteriormente. Muchos autores han descrito que el resveratrol no es oxidable por LOX pero eso no es del todo cierto. A valores de pH inferiores a su primer pKa, es decir cuando la estructura de esta molécula permanece intacta, la actividad enzimática es prácticamente nula. Sin embargo, cuando se produce la deprotonación del primer hidroxilo LOX empieza a oxidar rápidamente a este estilbeno. Posteriormente, y conforme nos acercamos al segundo de los pKas, la actividad vuelve a decaer.

Estos resultados que fueron publicados en otro artículo de la misma revista titulado Effect of protonation and aggregation state of (E)-resveratrol on its hydroperoxidation by lipoxygenase confirman que el pH del medio no solamente influye sobre la estructura de una enzima implicada en una reacción catalítica sino que pueden afectar significativamente al sustrato de la misma y, por tanto, a la reacción enzimática global.

Y en unos tiempos donde surrealistamente hay gente que solamente valora la investigación aplicada y no la básica¿cómo podríamos convencerlos de la relevancia de los resultados obtenidos? Pues voy a intentar explicárselo de la forma más clara posible:

Si combinamos los resultados del grupo de investigación eslovaco con los de nuestro grupo de investigación se puede llegar a la conclusión de que cualquier disolución acuosa de resveratrol debe prepararse a pHs inferiores a 8.8 no solamente para evitar fenómenos de oxidación de este estilbeno sino para que pudiese llegar a tener algún efecto positivo sobre la salud… cosa que habrá que demostrar posteriormente en estudios en humanos antes de echar las campanas al vuelo.

¿Y por qué muchos grupos de investigación trabajan con el resveratrol a pHs superiores a 9 si se ha demostrado que su utilidad es prácticamente nula? Pues deberían ser ellos los que respondieran pero… ¿no será que a pHs ácidos o neutros, los adecuados, el resveratrol es altamente insoluble y hace falta emplear disolventes orgánicos o métodos de encapsulación para “aumentar” su solubilidad lo que es un engorro? Ay pillines que a veces el camino más corto no es el correcto…

¿Mola eh? Para un amante de la bioquímica, de la enzimología, del resveratrol y de las técnicas de absorbancia y fluorescencia muchísimo pero para ustedes no lo sé, sobre gustos…

De todas formas les voy a hacer una pregunta… ¿es posible que esa actividad catalítica de LOX sobre el sustrato resveratrol sea dependiente no solamente del estado de protonación de este sustrato sino también de otro factor como su concentración? La respuesta es sí, mucho más de lo que la ley de Michaelis-Menten pueda predecir, pero eso se lo contaré en un siguiente post… no sea que las enzimas, unas marquesas caprichosas que solamente trabajan cuando y como ellas quieren, se molesten.

Jose

Nota:

Esta es mi primera participación en la XV Edición del Carnaval de Química que acogerá el joven y entusiasta químico Luis Moreno Martínez (@luisccqq) en su Blog El cuaderno de Calpurnia Tate y en la XIII Edición del Carnaval de Biología que se celebra en el gran Blog Caja de Ciencia de Marisa Alonso ( @lualnu10).

Bibliografía:

  • López-Nicolás J.M, García-Carmona F. Aggregation state and pKa values of (E)-resveratrol as determined by fluorescence spectroscopy and UV-visible absorption. J.Agric.Food Chem. 2008, 56, 7600-7605.
  • López-Nicolás JM, Pérez-Gilabert M, García-Carmona F. Effect of protonation and aggregation state of (E)-resveratrol on its hydroperoxidation by lipoxygenase. J Agric Food Chem. 2009 Jun 10;57(11):4630-5.
  • Ovesna´, Z.; Horva´thova´-Kozics, K. Structure activity relathioship of trans-resveratrol and its analogues. Neoplasm.
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12 respuestas a Enzimas y sustratos…marquesas y plebeyos

  1. Pingback: Enzimas y sustratos…marquesas y plebeyos

  2. Estoy pensando en secuestra al Resveratrol! muhahahahahaha

  3. Huno dijo:

    Muy buen post, para otro amante de la enzimología y que tiene la suerte de dedicarse a ello es gratificante leer un post divulgativo de estas características.
    Te quería comentar que estos estudios sobre el sustrato son esenciales antes de apuntar a que ale, ya cambia la estructura de la enzima y a tomar por saco la actividad. Nosotros trabajamos con enzimas de hipertermófilos, y en reacciones a altas temperaturas es esencial ver antes si los sustratos van a aguantar las condiciones del medio (que no son nada amigables!).
    Un saludo, y enhorabuena por el blog.

  4. Al dijo:

    Excelente, gracias.

  5. Genial, y muy oportuna la viñeta de la rueda.
    Carla
    http://www.lasbolaschinas.com

  6. luis dijo:

    ¡Pedazo de artículo! Es cierto, estudiamos cómo el medio afecta a la estructura y función de las enzimas pero obviamos los cambios que se pueden producir en los sustratos. Gracias, muy interesante.

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