El pasado viernes fue un gran día, y no debido a las decisiones del consejo de ministros como ya podrán imaginar, sino por la concesión de mi tercer sexenio de investigación. Pues bien, por razones que luego les explicaré, Sauron, el señor oscuro de Mordor, no ha encontrado mejor manera de celebrarlo que escribiendo un nuevo capítulo de la serie “La Comunidad del Anillo y los Ejércitos Encapsulantes” en el que tras la caída de Légolas, Gimli, Merry, Pippin y algún que otro miembro de la triste comunidad del anillo hoy, uno de los principales protagonistas, el patético Aragorn, van a ser encapsulado… y de paso alguno más.

Como ustedes bien saben en El Señor de los Anillos el número 6 jugaba un papel primordial ya esta obra maestra se compone de 6 libros, de 6 apéndices y 6 son para muchos los principales componentes de la comunidad (Frodo, Sam, Aragorn, Légolas, Gandalf y Gimli)… y ya que estamos con el número 6, los protagonistas del episodio de hoy van a ser los ácidos grasos omega 6, principalmente uno de ellos, el ácido linoleico que, por causas que iremos develando, está íntimamente relacionado con un lamentable personaje: Aragorn, hijo de Arathorn, heredero de Isildur.

El ácido linoleico (18:2ω-6) pertenece a la familia de los ácidos grasos omega-6 ya que el primer doble enlace a contar desde el carbono omega, es decir el que lleva el grupo metilo (-CH3), está en posición 6, y aunque no sea mediático como los famosos ácidos grasos omega-3, ni tampoco esté tan rodeados de los mitos y realidades de estos últimos como ya demostramos en un anterior post, son en algunas ocasiones más fiables.

Concretamente, y en el caso de la eficacia contra el colesterol, mientras que la EFSA ha desestimado el requerimiento de algunas empresas para poder publicitar que los omega-3 pueden regular sus niveles, el máximo organismo europeo en materia alimenticia sí que ha dado el visto bueno a los estudios científicos que muestran que el rey de los ácidos grasos omega 6, el ácido linoleico, rey de Arnor y Gondor, es capaz de hacerlo cuando esté presente en alimentos que aporten un mínimo de 1,5 g de ácido linoleico por 100 g y 100 Kcal.

Por otra parte, y desde el punto de vista organoléptico, el ácido linoleico juega un papel fundamental en el desarrollo de aromas y sabores en el reino vegetal al ser precursor de algunos los conocidos compuestos C6 y C9 que tanto interés tienen en el perfil sensorial de los alimentos. Concretamente, la oxidación vía enzimática de este ácido graso poliinsaturado puede dar lugar a determinados “off flavours” que proporcionan un desagradable olor en algunos productos.

Pues bien, debido a la gran importancia del ácido linoleico en el campo de la nutrición, la bioquímica y hasta la gastronomía, Sauron puso ya hace tiempo sus ojos en el heredero de Isildur para que sus ejércitos encapsulantes preferidos, las ciclodextrinas formadas por anillos de glucosa , lo atrapasen al igual que lo hicieron en capítulos anteriores con sus compañeros de la Comunidad del Anillo. Sin embargo, la tarea fue mucho más complicada que la que pudimos leer cuando atrapamos a Légolas, Gimli, Merry o Pippin… y a punto estuve de tirar la toalla. Veamos.

En principio el plan era fácil. Identificar al ácido linoleico en su región del espectro electromagnético, encapsularlo como había hecho con otras moléculas y posteriormente oxidarlo hasta hacerlo desaparecer… porque al que llegó a ser Rey de Arnor y Gondor no bastaba con atraparlo, había que destrozarlo. Sin embargo las dificultades llegaron desde el primer momento.

Una de las grandes similitudes entre Aragorn y el ácido linoleico es su capacidad de aglutinar adeptos a su causa. Al igual que el protagonista de la comunidad del Anillo tenía gran facilidad para rodearse de otros personajillos que siempre le hacían caso cual perrillos falderos, el ácido linoleico, un ácido graso poliinsaturado de naturaleza esencial para el organismo humano ya que no puede sintetizarlo por lo que tiene que ser ingerido por la dieta, presenta un fenómeno de agregación en disolución por el cual a partir de cierta concentración, denominada concentración micelar crítica (CMC), los monómeros de ácido graso (de naturaleza trasparente) se convierten en estructuras micelares (turbias)… ¿Y eso es un problema?

Pues sí, principalmente para su caracterización espectroscópica. ¿Por qué? Porque la absorción del ácido linoleico se produce en la región espectroscópica del ultravioleta, concretamente a 210 nm, y en esa zona del espectro las disoluciones deben estar totalmente trasparentes para poder ser analizadas en cubetas de cuarzo… ¿Y esto que implica? Pues que el ácido linoleico es imposible caracterizarlo en disolución acuosa a concentraciones por encima de la CMC ya que la disolución se pone totalmente turbia…¡¡maldito Aragorn que ya se me escapaba otra vez!!

Para poder resolver este problema pensé en emplear una de mis técnicas favoritas, la cromatografía líquida de alta resolución, pero el HPLC es mala técnica para caracterizar ácidos grasos…mejor la cromatografía gaseosa, pero ésta tampoco es buena compañera de viaje cuando posteriormente se quiere monitorizar “on line” la oxidación del ácido linoleico enzimáticamente.

La única solución era eliminar esa turbidez de cualquier forma para poder seguir empleando la espectroscopía ultravioleta, así que el Señor Oscuro de Mordor tuvo que recurrir de nuevo a sus tropas encapsulantes.

La idea fue la siguiente: encapsulo al ácido linoleico en el interior de mis ciclodextrinas de forma que se establezca un equilibrio físico-químico entre el ácido graso existente en la cavidad interna de mi agente encapsulante y el que queda en el exterior. Así, la ciclodextrina actúa como una especie de reservorio que acumula monómeros sin que en el medio de reacción la concentración sobrepase la CMC y, por tanto, jamás este medio se pondrá turbio… ¿fácil no? Pues SÍ pero NO. ¿Cómo?

SÍ porque una vez lograda la encapsulación molecular del famoso omega 6 todo sería más fácil y NO porque en el estudio de dicha encapsulación Aragorn nos tenía preparadas varias sorpresas difíciles de sortear. La primera de ellas fue que, a diferencia del resveratrol, pinosilvina, pterostilbeno y otras moléculas que han sido protagonistas en capítulos anteriores, los ácidos grasos no son moléculas fluorescentes por lo que la fluorescencia, mi técnica preferida para caracterizar la encapsulación de moléculas bioactivas, no parecía ser la metodología más adecuada… pero al Gran Ojo sin Párpado no se le escapa una y lo solucioné introduciendo una sonda fluorescente (DPHT) en el sistema de dobles enlaces del ácido linoleico que le permitiese comportarse como una molécula fluorescente “per sé”.

A bajas concentraciones de ácido graso la sonda no fluorece ya que está expuesta al medio externo de naturaleza hidrofílica pero al superar la CMC dicha sonda se acomoda en el interior hidrofóbico de la micela e incrementa súbitamente su rendimiento fluorescente.

De esta forma, tal y como se ve en la figura 1, se pudo calcular “fácilmente” la CMC en ausencia y en presencia de ciclodextrinas. Sin agentes encapsulantes en el medio de reacción la CMC es muy baja (lo que explica la turbidez del medio) pero en presencia de ciclodextrinas la CMC aumenta al introducirse los monómeros en la cavidad interna de las mismas y así dificultarse el fenómeno de agregación del ácido linoleico… con lo que el medio se mantiene transparente y mi querido Aragorn, digo el ácido linoleico, se puede caracterizar espectroscópicamente sin problemas en la región del ultravioleta. ¿Punto y final a la historia? Ni mucho menos… el hijo de Arathorn se siguió defendiendo como gato panza arriba.

En teoría, mediante el análisis del incremento de la CMC en presencia de ciclodextrinas, y para cuantificar la encapsulación de nuestro omega 6 favorito mediante el cálculo de las pertinentes constantes de encapsulación, solamente debíamos seguir el modelo matemático 1:1 descrito en los capítulos anteriores de esta serie por el que una molécula de ciclodextrina perteneciente a mis ejércitos encapsulantes atrapaba a una molécula bioactiva de la comunidad del anillo… pero los datos experimentales mostraban que el ácido linoleico no presentaba el patrón habitual de encapsulación así que tuve que plantear otro modelo matemático.

Había infravalorado a mi enemigo. Creía que con solo una ciclodextrina podría encapsular a Aragorn pero no. Su larga cola alifática me obligó a introducir una segunda molécula de mis agentes encapsulantes…y todo cuadró con un modelo matemático 1:2.

Este nuevo modelo propone que la habitual constante de encapsulación K que define la interacción entre una ciclodextrina y una molécula huésped sería sustituida por 2 constantes, K1 y K2, correspondientes a la hipotética interacción entre las dos moléculas de ciclodextrinas y el ácido linoleico … y con este modelo, y tras establecer las correspondientes e infumables ecuaciones matemáticas, el ajuste de los datos experimentales fue perfecto pudiéndose obtener los valores de estas dos constantes. Ya te tengo Aragorn, Capitán de los Dunedain del Norte… o eso creía yo.

Aragorn era un tipo listo y cuando se vio acorralado intentó una última forma de escapatoria: desplazar el campo de batalla a un escenario de pHs alcalinos. ¿Por qué? Porque en esa región el ácido linoleico se deprotona rápidamente al traspasar los límites de su pKa y la encapsulación es más difícil. Pero uno ya lleva mucha lucha contra estos impostores de la Comunidad del Anillo y logré encapsularlo en todas las regiones de pH aunque, como se puede observar en la siguiente imagen, la primera constante de encapsulación fue fuertemente dependiente del pH del medio ya que su valor cayó significativamente a pHs altos… aunque aún no estaba todo controlado.

Cuando mis tropas cantaban victoria Aragorn se sacó un as de la manga…subir la temperatura del medio ya que, como hemos comentado en pasados episodios, un incremento de la temperatura debilita las fuerzas de encapsulación existentes entre las ciclodextrinas y la mayoría de los agentes bioactivos salvo contadas excepciones… pero eso fue su perdición definitiva porque una de esas raras excepciones son los complejos ciclodextrina/ácidos grasos donde al subir  la temperatura del medio el agente bioactivo queda atrapado con mayor fuerza debido que ese incremento de temperatura lleva asociados cambios en el pKa del ácido linoleico que favorecen la encapsulación …y así no solo el Rey de Arnor y Gondor claudicó, sino que sus íntimos amigos Boromir, heredero de Denethor de Minas Tirith y Elrond el medio elfo, Gran Señor de los Elfos de Rivendell, reencarnados en los ácidos araquidónico y linolénico corrieron igual suerte y también fueron atrapados siguiendo el mismo sistema.

Lo siento Aragorn. Has sido un duro competidor que hubieses merecido mejor suerte pero jamás te perdoné que fueses hijo de Arathorn, heredero de Isildur que, por si no te acuerdas, fue el que cortó el Anillo de mi mano desencadenándose la gran batalla de la Tierra Media. En su día mis Orcos mataron con sus flechas a Isildur…y hoy te ha tocado a ti querido.

Además, no creo que te deje ver a tu amada Arwen, la hija de Elrond, porque una vez que has sido encapsulado por mis ciclodextrinas, dentro de poco mi enzima preferida, la lipoxigenasa, dará buena cuenta de ti oxidándote como te mereces, pero eso será en un próximo capítulo…. justo el que precede a la caída de mi principal objetivo. Sí Frodo Bolsón de Bolsón Cerrado, me refiero a ti… te queda muy poco de vida ñoño Hobbit.

Antes de acabar y para que no me venga con el rollo de que esto es investigación básica y no sirve para nada les voy a decir una cosa. ¿Qué aplicación práctica puede tener encapsular al ácido linoleico? Pues con los datos que les he dado hay un ejemplo bien claro y que contaría con las bendiciones de la EFSA: enriquecer una leche totalmente desnatada en un ingrediente bioactivo lipofílico (ácido linoleico) que sirva para bajar regular los niveles de colesterol y cuya perfil sensorial sea óptimo al estar dicho ácido protegido de los procesos de oxidación… ahí lo dejo para quien quiera recoger el guante.

Concluyo. Si ustedes han llegado hasta aquí se habrán dado cuenta de que aún queda un secreto por descubrir. Les dije al principio de este post que con esta entrada quería celebrar mi tercer sexenio de investigación… ¿y por qué con este artículo y no con otro? Pues porque parte de lo expuesto hoy en Scientia pueden encontrarlo en la revista Biochemical Journal en el que fue mi primer artículo de investigación en el año 1995 y en mi tesina de Licenciatura. Sí, ya soy muy mayor, pero Sauron está hecho un chaval… que no se les olvide.

Jose

Nota: Esta es mi tercera aportación a la XVI Edición del Carnaval de la Química que este mes se celebra en uno de mis blogs de referencia, “Jindetrés ,sal”, de mi gran amigo Carlos Romá y a la Edición “3,14159 del Carnaval de Matemáticas” que  durante este mes de Junio se alberga en nuestra propia casa.